小麥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒通用原則

小麥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒通用原則：

1， 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近于探針。

2， 擴(kuò)增子的長(zhǎng)度應(yīng)不超過(guò)400bp，理想的*能在100－150bp內(nèi)，擴(kuò)增片斷約短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，及在SG分析中非特異信號(hào)。

4， 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）

5， 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

b），探針設(shè)計(jì)指導(dǎo)

1，在設(shè)計(jì)引物之前設(shè)計(jì)探針

2，探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測(cè)探針，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)。

3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會(huì)有淬滅作用，即使被切割下來(lái)這種淬滅作用也還會(huì)存在

4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。

6， 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過(guò)30個(gè)bp。

7， 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。

PCR實(shí)驗(yàn)步驟

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：

將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

??人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；

??耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。